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Title: Isolamento e caracterização bioquímica e biológica de um peptídeo antimicrobiano extraído da peçonha do escorpião Tityus obscurus Gervais 1843 (Scorpiones Buthidae)
metadata.dc.creator: CARVALHO, Brenna Celina Ferreira de
Keywords: Candida albicans;Peptídeo antimicrobiano;Tityus obscurus
Issue Date: 18-Apr-2017
Publisher: Universidade Federal do Oeste do Pará
Citation: CARVALHO, Brenna Celina Ferreira de. Isolamento e caracterização bioquímica e biológica de um peptídeo antimicrobiano extraído da peçonha do escorpião Tityus obscurus Gervais 1843 (Scorpiones Buthidae). Orientador: Joacir Stolarz de Oliveira; Coorientadora: Deyanira Fuentes Silva. 2017. 45 f. Dissertação (Mestrado em Recursos Naturais da Amazônia) - Programa de Pós-graduação em Recursos Naturais da Amazônia, Universidade Federal do Oeste do Pará, Santarém, 2017. Disponível em: https://repositorio.ufopa.edu.br/jspui/handle/123456789/259. Acesso:.
Abstract: Scorpion venoms are sources of bioactive molecules such as Antimicrobial Peptides (AMPs), which are innate immunity molecules and found in the animal and plant kingdoms. In this work, it was purified and characterized a novel AMP from the venom of the Amazonian scorpion Tityus obscurus. Animals were collected in the Tapajós National Forest, West region of Pará state, Brazil. The venom was extracted by electrostimulation technique, using a variable power supply. Molecular mass distribution in the venom was assessed running 15% SDS-PAGE. Purification of an antimicrobial peptide (P42) migrating at 42 min was done by High-Performance Liquid Chromatography (HPLC). For biological characterization, antimicrobial activity on the Gram-negative Escherichia coli, Gram-positive Staphylococcus aureus bacteria and fungi Candida albicans, C. tropicalis and C. parapsilosis were performed using the standard methods of disk diffusion sensitivity and Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) for bacteria (M2A-9 standard) and fungi (M44-A and M27-A2 standards). Additionally, mouse membrane hemolytic effect of the purified P42 was determined, as well as monitoring of the kinetic cytotoxicity by confocal microscopy images. The results of mass-spectrometric analysis showed a m/z ratio of 7284.4 Da and N-terminal amino acid sequence of the first 30 residues of the peptide determined by Edman degradation, which has a 97% identity with the previously reported nucleotide sequence of To4 precursor from T. obscurus. P42 was only active against fungi. MIC values against Candida species were 3.5-7.0 μM, compared to fluconazole 6.0-12.0 mM and it did not show hemolytic effect in mouse erythrocyte. These results report, for the first time, the purification and characterization of a native AMP from the venom of the Amazonian scorpion T. obscurus. This kind of biological molecules constitutes a novel approach to drug development, especially against multidrug-resistant pathogens.
metadata.dc.description.resumo: As peçonhas de escorpiões são fontes de moléculas bioativas como os Peptídeos Antimicrobianos (PAMs). Tais moléculas pertencem à imunidade inata e são ubíquas no reino animal e vegetal. Este trabalho teve o objetivo de purificar e caracterizar um peptídeo antimicrobiano extraído da peçonha do escorpião T. obscurus da região Oeste do Pará, Brasil. A coleta dos animais ocorreu na Floresta Nacional do Tapajós e a extração das peçonhas foi feita através da técnica de eletroestimulação usando uma fonte elétrica. O perfil eletroforético foi determinado pela eletroforese em gel de poliacrilamida 15% SDS-PAGE. O peptídeo antimicrobiano purificado (P42) teve eluição em 42 min através da Cromatografia Líquida de Alta Eficiência em fase reversa (rp-CLAE). Os ensaios antimicrobianos foram realizados com bactérias Escherichia coli Gram (-), Staphylococcus aureus Gram (+) e com fungos Candida albicans, C. tropicalis e C. parasiplosis através de métodos padronizados de sensibilidade por disco difusão e de determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) protocolados pela Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), para fungos (normas M44-A e M27-A2) e bactérias (norma M2A-9). O efeito hemolítico de P42 foi testado em eritrócitos de camundongos e para monitorar a cinética de sua citotoxicidade foram geradas imagens por microscopia confocal. A massa molecular de P42 foi obtida através da técnica de espectrometria de massas MALDI-TOF e a sua sequência de aminoácidos através da Degradação de Edman. O peptídeo (P42) foi ativo apenas contra o fungo C. albicans e a sua massa molecular foi de 7284,4 Da. Os valores de CIM do peptídeo contra as espécies de Candida foi 3,5 - 7,0 μM e para o fluconazol 6,0 - 12,0 mM. P42 não foi hemolítico em eritrócito de camundongos. A microscopia confocal detectou DNA espalhado após 3h de tratamento com o peptídeo natural. A estrutura primária desse peptídeo consistiu de 30 aminoácidos e 97% de identidade com a toxina To4 de T. obscurus. Esses resultados demonstram, pela primeira vez, a existência de um PAM nativo obtido diretamente da peçonha de T. obscurus, expandindo as opções de possíveis novas aplicações terapêuticas.
URI: https://repositorio.ufopa.edu.br/jspui/handle/123456789/259
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